L’eugénol

 

I.    Présentation

 

L’eugénol fait partie des molécules que l’on peut trouver dans certaines épices, telle le clou de girofle.

 

1.    Le clou de girofle1, 2

 

Ce que l’on a coutume de rencontrer sous le nom de clou de girofle sont les bourgeons séchés d'un arbre tropical : le giroflier ou Eugenia Caryophyllata de la famille des Myrtacées.

 

Fig. 1 : Eugenia Caryophyllata ; Merr. & L. M. Perry ; Image processed by Thomas Schoepke ; www.plant-picture.de

 

Dès le IIIème siècle av JC, le clou de girofle est connu par les Chinois pour ses propriétés médicinales. Jusqu’au Moyen Age où il servira à la conservation des aliments, il sera utilisé en raison de ses vertus médicinales et sa rareté en fait un véritable trésor.

A partir du XVème siècle la culture du giroflier, réalisée sur les Moluques (archipel Indonésien), fut très réglementée de façon à maintenir élevé le prix de cette épice.

Ca ne sera qu’à partir de 1773 que Pierre Poivre, botaniste français, réussira à acclimater l’arbre à des climats plus tempérés et permettra la démocratisation de l’épice.

 

Les bourgeons sont récoltés à maturité juste avant l'épanouissement de la fleur. Ils sont ensuite dégriffés (séparation du bouton du pédoncule) puis séchés au soleil ce qui les fait passer d'une couleur brun roux à brun foncé.

Actuellement, l’Indonésie reste le principal producteur de clous de girofle (71% de la production mondiale), suivie de Madagascar (12%) et de la Tanzanie (10%).

 

2.    L’huile essentielle de clou de girofle

 

L’huile essentielle de clou de girofle se présente sous la forme d’un liquide huileux (ce qui est normal), de couleur jaune fonçant au brun à la lumière.

 

Elle est obtenue traditionnellement par hydrodistillation (entraînement à la vapeur d’eau) du clou du girofle.

Il est aussi possible de l’obtenir par extraction du clou par un solvant organique mais l’huile est généralement  dans ce cas de qualité inférieure est raison de traces résiduelles du solvant.

On pourra noter qu’une étude3 menées en 2006 à montré qu’une extraction par le dioxyde de carbone supercritique est tout à fait possible avec un rendement maximum dans les conditions suivantes : pression de 10 MPa (méga pascal) et température de 50°C.

 

L’huile essentielle contient en moyenne 23 composés4 :

-         des sesquiterpènes : alpha et bêta caryophyllènes (de 7 à 10%), alpha et bêta humulènes, alpha amorphène, alpha muurolène, calaménène, calacorène.

-         des esters : hexanoates d'éthyle, acétates de 2-heptanyle, de 2-nonalyle, de styralyle, de benzyle, d'eugénol (de 4 à 10%), de terpényle et d'éthylphényle;

-         des phénols : eugénol (75 à 85%), cis et trans isoeugénol, chavicol, 4-allylphénol.

-         des oxydes : oxyde de caryophyllène, époxyde d’humulène.

 

Fig. 2 : β-caryophyllène5

 

Fig. 3 : Acétate d’eugénol

3.    La molécule d’eugénol

 

Fig. 4 : la molécule d’eugénol

Il s’agit du 4-allyl-2-méthoxyphénol.

On remarque que la molécule possède une fonction alcène (en rouge), une fonction éther : le groupement méthoxy en violet et une fonction phénol en bleu.

Il s’agit d’un liquide bouillant à 225°C et se solidifiant à -9°C, insoluble dans l’eau.

C’est cette molécule, constituant principal de l’huile essentielle de clou de girofle, que nous allons extraire et qui possède certaines propriétés biologiques justifiants son usage médicinal.

 

4.    Propriétés biologiques

 

La molécule d’eugénol possède deux principales propriétés biologiques : antiseptique et anesthésiante.

 

L’action antiseptique a été mise à profit très tôt et l’eugénol a été préconisé en tant que traitement de la tuberculose et de la gangrène pulmonaire6.

Cette propriété antispectique peut s’expliquer par l’action sur la membrane cellulaire7.

En effet les cellules sont entourées d’une membrane constituée principalement par des glycérophospholipides (répartis en une double couche) présentant la particularité de présenter à la fois une partie hydrophobe (apolaire et ‘’allergique‘’ à l’eau) et d’une partie hydrophile (polaire et ‘’aimant ‘’ l’eau).

 

Fig. 5 : Formule générale des glycérophospholipides

 avec R1 et R2 de longues chaînes hydrocarbonées d’acide gras

 et X un dérivé d’alcool polaire.

 

En présence d’eau (constituant majeur du corps humain), les têtes polaires s’orientent vers l’eau, tandis que les queues apolaires se rassemblent dans une zone exempte d’eau.

Les cellules sont donc entourées des glycérophospholipides qui s’organisent en double couche, isolant l’intérieur de la cellule du milieu extérieur :

 

Fig. 6 : Micrographie électronique d’un liposome8.

Le schéma annexé montre que la paroi est constituée d’une bicouche lipidique.

En rouge les têtes polaires hydrophiles et en lignes noires, les queues apolaires hydrophobes.

 

Cette membrane est semi-perméable et permet le passage de petites molécules polaires non chargées et de gaz. L’eau peut faiblement passer mais les ions, et les grandes molécules polaires chargées ou non sont bloquées à l’extérieur9.

Des canaux ioniques (sortes de tunnels permettant le passage des ions à travers la membrane) et des protéines de transports (remplissant le même rôle que les canaux ioniques mais pour les molécules) permettent à certaines espèces chimiques de traverser la membrane.

 

L’eugénol va entraîner une perte de la perméabilité sélective de la membrane par changement de ses propriétés physiques. Cette dénaturation des protéines membranaires par l’eugénol est due à la coexistence d'une partie hydrophile et d'une partie lipophile10.

 

L’action anesthésique a été mise à profit dans le domaine dentaire11. Par le mélange d’oxyde de zinc et d’eugénol on obtient un ciment utilisé en tant que matériaux de restauration temporaire permettant à la fois un excellent scellement et une anesthésie de la pulpe. Qui plus est, ce ciment est en général très bien toléré par les patients.

 

L’eugénol est ainsi toujours utilisé de nos jours, principalement dans les préparations dentaires : bains de bouche, pâte dentifrice, ciments…

 

Assez récemment, de nouvelles données et applications concernant ce produit sont apparues :

 

-         une étude12 a montré que l’addition d’une petite quantité d’eugénol (remplaçable par du thymol) à l’atmosphère contrôlée appliquée pour l’emballage des grappes de raisins permet d’améliorer la conservation du goût et des propriétés nutritionnelles tout en ralentissant le développement microbien.

-         des propriétés anti-inflammatoires ont été prouvées13 in-vitro par l’action inhibitrice de l’eugénol sur la 5-lipooxygénse, une enzyme impliquée dans le cadre de la réponse inflammatoire.

 

Cependant l’eugénol présente tout de même certains risques :

-         il s’agit d’un produit irritant pour la peau

-         l’eugénol possède une cytotoxicité non négligeable due à la formation de radicaux phénoxy.

-         il est suspecté d’être un possible cancérigène14. En effet, dans certaines conditions (présence du cytochrome P450 CYP2D et d’ions cuivre Cu2+), on peut noter une déméthylation de l’eugénol conduisant à l’hydroxychavicole, suspecté d’entraîner des dommages sur l’ADN.

 

Fig. 7 : la molécule d’hydroxychavicole

 

Je tiens à préciser que cette dernière remarque ne vise qu’à montrer que l’eugénol n’est pas un produit dénué de toxicité.

Ainsi l’eugénol n’est pas du tout un produit cancérigène avéré.

 

 

 

II.    Extraction à partir du clou de girofle

 

Bien que l’eugénol présente un point d’ébullition élevé (225°C) et soit insoluble dans l’eau, il forme avec ce dernier un azéotrope distillant à une température voisine de 100°C.

Par refroidissement de la vapeur, il y a ensuite démixtion (séparation) de l’eau et de l’huile essentielle.

 

 

1.    Matériel et produit utilisés.

 

1. Ballon tricol 250 ml

2. Ballon bicol 250 ml

3. Ampoule de coulée 250 ml

4. Tube droit en verre de 50 cm de long

5. Tube en verre coudé

6. Petite colonne à distiller de Vigreux

7. Thermomètre rodé

8. Réfrigérant de Liebig

9. Allonge à distiller

10. Erlenmeyer rodé de 250 ml

11. Ampoule à décanter de 2 l

12. Deux chauffe-ballons

13. Erlenmeyer de béchers correspondants

14. Clous de girofle

15. Eau distillée

16. Chlorure de sodium

17. Ether de pétrole

18. Sulfate de magnésium

19. Toluène

20. Méthanol

21. Solution de soude à 2 M

22. Acide chlorhydrique concentré


 

2.    Mode opératoire

 

 

  1. On prépare le montage ci-dessous :

 

Fig. 8

 

S’assurer que le tube droit plonge bien dans l’eau du premier ballon et de que le tube coudé plonge bien au fond du deuxième ballon.

  1. Réduire 100 g de clous de girofle en poudre au moyen d’un mixeur et placer la poudre obtenue dans le ballon d’extraction.
  2. Introduire dans le ballon d’extraction 150 ml d’eau distillée et homogénéiser à l’aide d’une baguette ou d’une spatule.
  3. Introduire dans le premier ballon (générateur de vapeur) 150 ml d’eau distillée et quelques grains de pierre ponce ou de carborundum. Remplir l’ampoule de coulée avec de l’eau distillée.
  4. Faire chauffer le contenu des deux ballons grâce aux chauffe-ballons. Dès que de la vapeur d’eau générée dans le premier ballon parvient au deuxième sous forme de bulles régulières, arrêter le chauffage du deuxième ballon.
  5. Distiller à vitesse régulière tout en rajoutant de l’eau dans le ballon générateur de vapeur par l’intermédiaire de l’ampoule de coulée.

La distillation est poursuivie jusqu’à obtention d’environ un litre de distillat.

  1. Saturer le distillat en chlorure de sodium.
  2. Transférer le distillat dans l’ampoule à décanter de 2 l et extraire par trois fois 250 ml d’éther de pétrole. Les phases organiques sont rassemblées.

Mettre de coté quelques gouttes de la phase organique pour analyse ultérieure.

  1. Extraire la phase organique par 3 fois 200 ml d’une solution de soude à 2 mol.L-1. Les phases aqueuses sont rassemblées et la phase organique est conservée.
  2. Acidifier la phase aqueuse par ajout d’acide chlorhydrique concentré jusqu’à obtention d’un pH = 1.
  3. Extraire la phase aqueuse par 3 fois 200 ml d’éther de pétrole.
  4. Sécher la phase organique avec du sulfate de magnésium et filtrer.
  5. La phase organique est évaporée à l’évaporateur rotatif jusqu’à l’obtention d’une huile jaunâtre.

 

 

 

III.    Résultats et discussion

 

Le type de montage utilisé ici permet de réaliser l’extraction de l’huile essentielle de clou de girofle (et donc de l’eugénol, son principal composant) par hydrodistillation avec génération de la vapeur d’eau ex-situ.

 

Le tube droit plongeant dans l’eau du premier ballon permet d’assurer un équilibrage de pression en empêchant le contenu du deuxième ballon d’être aspiré dans le ballon 1 lors d’un refroidissement de celui-ci, par exemple lors de l’ajout d’eau par l’ampoule.

 

De façon à limiter les pertes de chaleur, il peut être utile d’entourer les ballons, le tube de transfert de vapeur et la colonne de Vigreux par du papier d’aluminium.

 

Le fait d’ajouter du chlorure de sodium est l’opération de relargage. En clair, il s’agit de diminuer la solubilité de l’eugénol dans l’eau et de favoriser sa séparation.

Cette opération est basée sur la modification des sphères de solvatation… Un mot bien savant pour un phénomène physique assez simple.

En effet lorsque l’on dissout un composé dans de l’eau, les molécules H2O vont avoir tendance à entourer le composé à dissoudre (le soluté) de façon à favoriser sa dissolution.

Ainsi une molécule d’eugénol va être plus ou moins entourée de molécules d’eau, répartie sous forme de sphère. On dira alors que la molécule est solvatée et la sphère correspondante de molécules d’eau est la sphère de solvatation.

Lors de l’ajout de sel, les molécules d’eau vont entourer les ions sodium Na+ et chlorure Cl- pour permettre la dissolution du sel.

L’eugénol étant un composé peu polaire, les molécules d’eau auront tendance à entourer plus facilement les ions que notre molécule.

L’eugénol va ainsi être de moins en moins solvaté par l’eau et va donc se séparer plus facilement.

 

Fig. 9

 L’eugénol (molécule peu polaire) est extraite avec un solvant organique non miscible à l’eau (l’éther de pétrole). Notons que le cyclohexane peu également convenir en tant que solvant d’extraction.

En revanche l’hexane, pour des questions de toxicité, ne sera pas employé.

 

Nous avons vu précédemment que l’huile essentielle de clou de girofle est constituée majoritairement d’eugénol et d’un peu d’acétate d’eugénol.

Un simple lavage acido-basique permet de séparer ces deux composés. En effet, en milieu basique, la fonction phénol de l’eugénol est déprotonnée et le phénolate correspondant est hydrosoluble.

Il ne reste donc que de l’acétate d’eugénol dans la phase organique.

L’acidification de la phase aqueuse par l’acide chlorhydrique permet de reprotonner le phénolate d’eugénol en eugénol qui est extrait par un solvant organique.

 

Fig. 10

 

Les analyses CCM des phases organiques avant et après traitement montrent nettement la disparition de l’acétate d’eugénol.

Les CCM sont réalisée sur des plaques Merck, éluant : toluène/méthanol (95/5) révélées à l’iode.

 

Fig. 11 : CCM –   A droite : l’huile après lavage acido-basique

A gauche : l’eugénol avant lavage.

Rf acétate d’eugénol = 0.94 ; Rf  eugénol = 0.66

 

Il a été précisé précédemment que l’huile essentielle de clou de girofle contient 23 produits. Sur la plaque CCM, nous pouvons voir en réalisant un dépôt concentré la présence de certains de ces composés. L’obtention d’eugénol pur ne pourrait se faire sans passer par des méthodes chromatographiques (type HPLC : Chromatographie Liquide Haute Performance).

Ainsi nous ne récupérons par l’eugénol pur à 100 % mais avec une pureté en générale comprise entre 80 et 90 %.

 

L’eugénol brut est obtenue sous forme d’une huile jaunâtre qui brunit à la lumière,

m = 4.595 g.

 

Fig. 12 : eugénol brute, exempt d’acétate

 

Comme lors de la plupart des extractions de produits naturels, les rendements d’extraction varient en fonction de l’origine de la plante.

 

Deux tentatives de purifications de l’eugénol ont été envisagées :

-         Par chromatographie liquide :

On tentera de purifier 300 mg d’eugénol (débarrassé de l’acétate correspondant). On utilise 18 g de silice sphérique de 0.2 à 0.5 mm de diamètre.

L’éluant est un mélange toluène/méthanol (95/5). On récupère des fractions de 10 ml chacune.

Par analyse CCM, on se rend compte que la séparation n’a pas lieu et que l’on obtient l’eugénol avec les impuretés de départ.

L’utilisation de silice plus fine et d’un gradient d’élution est à envisager mais ne sera pas développée plus en avant.

 

-         Par distillation fractionnée :

On utilise un montage classique de distillation fractionnée sous vide avec une petite colonne de Vigreux.

On part de 4.295 g d’eugénol (exempt d’acétate).

Sous une pression de 25 mm de mercure, l’eugénol distille à une température d’environ 140°C (en tête de colonne).

 

On obtient après distillation 3.247 g d’un liquide huileux incolore.

 

Par analyse CCM, on observe toujours la présence d’impuretés mais en proportions moindres ; de plus, l’eugénol obtenu est incolore alors que l’eugénol avant distillation présentait une coloration brune.

 

Fig. 13 : CCM - A droite : eugénol après distillation.

A gauche : eugénol avant distillation.

Fig. 14 : Eugénol après distillation

 

Ainsi la distillation fractionnée donne un premier résultat intéressant puisqu’on obtient un produit de pureté supérieure à celle du produit initial.

Cependant, il faudrait améliorer la méthode (utilisation d’une colonne avec un plus grand nombre de plateaux) ou bien réaliser plusieurs distillations successives.

Cependant en raison du volume mort du système de distillation, les pertes de produits sont importantes.

A noter que les pertes de produit dû au volume mort seront réduites en utilisant un four à boules.

 

Ainsi la purification de l’eugénol obtenu par extraction n’est pas aisée.

Cependant, pour des manipulations ne demandant pas des produits purs, le produit obtenu après distillation sera généralement utilisé.

 

Le spectre IR15 est disponible ici.

 

Le spectre RMN15 est disponible ici.

 

 

 

IV.    Produits utilisés

 

-         Eau : H2O.

 

-         Chlorure de sodium : NaCl.

 

-         Ether de pétrole : Mélange d’hydrocarbure de point d’ébullition compris entre 35 et 60°C ; Facilement inflammable, nocif, dangereux pour l’environnement.

Risque : R 11 : Facilement inflammable.

               R 38 : Irritant pour la peau.

               R 51/53 : Toxique pour les organismes aquatiques, peut entraîner des effets néfastes à long terme pour l’environnement aquatique.

               R 65 : Nocif : peut provoquer une atteinte des poumons en cas d’ingestion.

               R 67 : L’exposition répétée peut provoquer dessèchement ou gerçures de la peau.

Conseils de prudence : S 9 : Conserver le récipient dans un endroit bien ventilé.

                                     S 23 : Ne pas respirer les vapeurs.

                                     S 33 : Eviter l’accumulation de charges électrostatiques.

                                      S 37 : Porter des gants appropriés.

                                     S 57 : Utiliser un récipient approprié pour éviter toute contamination du milieu ambiant.

                                     S 60 : Eliminer le produit et son récipient comme un déchet dangereux.

  S 61 : Eviter le rejet dans l’environnement.

  S 62 : En cas d’ingestion, ne pas faire vomir. Consulter immédiatement un médecin et lui montrer l’emballage ou l’étiquette.

 

-         Sulfate de magnésium : MgSO4

 

-           Toluène : C7H8 ; Facilement inflammable, nocif

Risque : R 11 : Facilement inflammable.

               R 20 : Nocif par inhalation.

Conseils de prudence : S 16 : Conserver à l’écart de toute flamme ou source d’étincelles. Ne pas fumer.

                                     S 25 : Eviter le contact avec les yeux.

                                     S 29 : Ne pas jeter les résidus à l’égout.

                                     S 33 : Eviter l’accumulation de charges électrostatiques.

 

-         Méthanol : CH4O ; Facilement inflammable, toxique.

Risque : R 11 : Facilement inflammable.

               R 23/24/25 : Toxique par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion.

               R 39 : Dangers d’effets irréversibles très graves.

Conseils de prudence : S 7 : Conserver le récipient bien fermé.

                                     S 16 : Conserver à l’écart de toute flamme ou source d’étincelles. Ne pas fumer.

                                     S 36/37 : Porter un vêtement de protection et des gants appropriés.

                                     S 45 : En cas d’accident ou de malaise consulter immédiatement un médecin (si possible lui montrer l’étiquette).

 

-         Solution d’hydroxyde de sodium : NaOH ; Corrosif

Risque : R 35 : Provoque de graves brûlures.

Conseils de prudence : S 26 : En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement et abondamment avec de l’eau et consulter un spécialiste.

                                     S 37/39 : Porter des gants et un appareil de protection des yeux/du visage.

                                     S 45 : En cas d’accident ou de malaise consulter immédiatement un médecin (si possible lui montrer l’étiquette).

 

-         Acide chlorhydrique concentré : HCl

Risque : R 34 : Provoque des brûlures.

               R 37 : Irritant pour les voies respiratoires.

Conseils de prudence : S 26 : En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement et abondamment avec de l’eau et consulter un spécialiste.

                                     S 36/37/39 : Porter un vêtement de protection approprié, des gants et un appareil de protection des yeux/du visage.

                                   S 45 : En cas d’accident ou de malaise consulter immédiatement un médecin (si possible lui montrer l’étiquette).

 

 

 

V.    Bibliographie

 

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2          http://www.toildepices.com/index.php?url=/fr/plantes/angio_dic/myrtacee/eugenia/ caryophyllata.php

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6          Lebeau P., Courtois G. ; Traité de pharmacie chimique – Tome II, Masson et Cie, 1929

7          http://www.ustboniface.mb.ca/cusb/abernier/Biologie/Cellule/membrane-feuilles-etudiants-2.html

8          Voet D., Voet J.G. ; Biochimie, 2ème ed, De Boeck

9          http://membres.lycos.fr/agroveto/page/permea/permabilite.htm

10        http://www.biam2.org/www/Sub1637.html

11        http://www.cda-adc.ca/jadc/vol-64/issue-11/788.html

12        Valeroa D.,  Valverdea J.M., Martínez-Romeroa D. ; Postharvest Biology and Technology, 41 (2006) 317-327

13        H. Raghavenraa H., B.T. Diwakra B.T. ;  Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids, 74 (2006) 23-27

14        Sakano K., Inagaki Y., Oikawa S. ; Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 565 (2004) 35-44

15        http://www.aist.go.jp/RIODB/SDBS/cgi-bin/direct_frame_top.cgi?lang=eng