La chromatographie sur couche mince (CCM)

 

Il s’agit là d’une technique d’analyse, très utile et simple à mettre en œuvre.

On l’utilise en général pour suivre l’avancement d’une réaction, pour connaître la composition d’une fraction séparée sur colonne ou visualiser la pureté d’un produit.

 

 

I.                 Principe

 

La chromatographie sur couche mince repose sur les phénomènes d’adsorption et d’interactions.

On place un composé sur un support solide (appelé phase stationnaire) et l’on applique alors un solvant (phase mobile) qui, par capillarité, va ‘monter’ et se déplacer sur la phase stationnaire.

 

Le phénomène de capillarité est très simple à montrer puisqu’il suffit de plonger le bout d’un mouchoir dans un liquide. On voit alors ce dernier monter dans le mouchoir par…. capillarité !

 

La phase mobile, en montant dans la phase stationnaire, va entraîner le composé que l’on avait déposé, et ce à une hauteur variant en fonction du composé et du solvant.

En effet, le composé va développer des interactions non seulement avec le solvant (phase mobile) mais également avec le support (phase stationnaire).

Ainsi le composé montera haut (on parle de migration) s’il a peu d’interactions avec le support ou bien s’il a une forte affinité pour le solvant.

La question est alors sur toutes les lèvres… Qu’elles sont ces interactions ?

Il s’agit ici d’interactions électrostatiques. Les composés sont soit polaires soit apolaire.

La phase stationnaire est ici polaire (silice, alumine).

Puisque ce sont les interactions qui sont responsables de la hauteur de migration, un composé polaire sur un support polaire se sentira comme chez lui et migrera moins haut qu’un composé apolaire, qui lui ne sera pas du tout à son aise sur ce support et donc qui cherchera à ‘foutre le camps’…

Le solvant entre lui aussi en compte puisqu’il va faire migrer le composé ; on classe donc les solvants en fonction de leur pouvoir éluant.

Prenons comme exemple une phase stationnaire polaire, un composé polaire et un solvant polaire. Le solvant polaire possède un pouvoir éluant élevé, fortement adsorbé, il déplace le composé. En revanche, un solvant apolaire possèdera un mauvais pouvoir éluant, mais entraînera un soluté apolaire.

Il existe ainsi des tables classant les différents solvants en fonction de leur fore éluotropique (pouvoir éluant)

 

 

II.             Le matériel

 

Pour réaliser ce type d’analyse, il nous faut :

 

une cuve chromatographique : un récipient habituellement en verre, de forme variable, fermé par un couvercle étanche.

 

la phase stationnaire : une couche d’environ 0,25 mm de gel de silice ou d’un autre adsorbant, fixée sur une plaque de verre, de plastique ou d’aluminium, à l’aide d’un liant comme le sulfate de calcium hydraté (plâtre de Paris), l’amidon ou un polymère organique. Il est important de préciser que l'on emploie pas le même type de phase stationnaire pour tout les produits. Par exemple, la silice étant légèrement acide, les produits sensibles (acétals par exemple) pourraient se décomposer. On préfère alors l'emploi d'alumine neutre.

 

Le choix de la plaque peut avoir son importance… Ainsi on n’utilisera pas une plaque de verre avec comme solvant un acide fluorhydrique ; ou une plaque d’aluminium en solution basique…

Certaines plaques sont traitées par une substance fluorescente qui permet la révélation aux UV.

 

l’échantillon : environ un microlitre de solution diluée (de 2 à 5 %) du mélange à analyser, déposé en un point repère situé au-dessus de la surface de l’éluant.

 

l’éluant (phase mobile) : un solvant pur ou un mélange.

 

Le choix du solvant peu être délicat, même pour les expérimentateurs confirmés et il faut le plus souvent faire des essais de séparation avant de se lancer vraiment dans l’analyse chromatographique.

On retiendra tout de même qu’un solvant polaire entraînera facilement  les substances polaires et peu les substances apolaires.

On peut s’aider de la table suivante :

 

Solvant

ε0

p’

Acide acétique glacial

> 0.73

6.2

Eau

> 0.73

10.2

Méthanol

0.73

6.6

Méthanol (40 %) + acétonitrile (60 %)

0.67

/

Méthanol (20 %) + éther diéthylique (80 %)

0.65

/

Propanol 2

0.63

4.3

Pyridine

0.55

5.3

Butanol 2

0.54

3

Acétonitrile

0.5

6.2

Acétate d’éthyle

0.45

4.3

Acétone

0.43

5.4

Méthyléthylcétone

0.39

4.5

Tétrahydrofuranne (THF)

0.35

4.2

Chloroforme

0.31

4.4

Terbutylméthyléther

0.29

/

Ether diéthylique anhydre

0.29

2.9

Benzène

0.27

3.9

Toluène

0.22

2.4

Tétrachlorure de carbone

0.14

1.6

Cyclohexane

0.03

0

Pentane

0

0

n-Hexane

0

0.06

n-Heptane

0

0.02

ε0 = force éluotropique

p’ = indice de polarité

 

III.   Conduite de la chromatographie

 

        1)     Dépôt de l’échantillon.

 

L’échantillon est mis en solution dans un solvant volatil, qui n’est pas forcément le même que l’éluant.

On trace sur la plaque à 1 cm du bord inférieur un très fin trait au crayon de papier qui servira à repérer les dépôts ; on veillera à ne surtout pas abîmer la surface de la plaque (ce qui fausserait l’analyse). La solution à analysée est alors déposée en un point de cette ligne.

 

Il est important que le diamètre de la tache produite au moment du dépôt soit faible. Il ne doit pas dépasser 3 mm.

Si trop peu de produit a été déposé, après avoir séché la plaque, on pourra recommencer le dépôt jusqu’à ce qu’on estime la quantité de produit suffisante.

 

L’échantillon est déposé à l’aide d’une micropipette ou d’un tube capillaire en appuyant légèrement et brièvement l’extrémité du tube sur la couche d’adsorbant en prenant soin de ne pas la détériorer.

 

Pour vérifier la présence d’un composé dans un mélange, on fera un dépôt du produit pur à coté du mélange. Ces témoins permettront de comparer la migration de chaque composé avec celle de l’échantillon à analyser.

  

        2)     Développement.

 

Il s’agit en fait de faire migrer les composés déposés.

 

Pour cela, on place dans la cuve un peu de solvant (sur une hauteur d’environ 0.5 cm) puis on introduit verticalement la plaque. L’éluant ne doit pas être en contact avec la tache de produit.

Pendant toute la durée de l’élution, la cuve restera fermée et ne devra pas être déplacée.

 

Une fois le solvant à environ 1 cm du bord supérieur de la plaque, on la sort et on marque le front du solvant au crayon. Puis on laisse sécher la plaque.

  

       3)     La révélation !

 

Lorsque les composants de l’échantillon analysé sont colorés, leur séparation est facilement observable sur la plaque ; dans le cas contraire, on doit rendre les taches visibles par un procédé de révélation. Les taches seront ensuite entourées au crayon.

 

Quelques méthodes de révélation :

 

- la plaque contient un indicateur fluorescent : on soumet la plaque à un rayonnement UV et les composés sont révélés sous forme de taches sombres.

 

- les UV (254 nm) : en exposant la plaque à une source de radiation UV, certains composés (systèmes conjugués ou aromatiques) apparaissent sous forme de taches brillantes.

 

- l’iode : on plonge la plaque dans un bocal contenant un fond d’iode broyé. Les composés apparaissent sous forme de taches brunâtres.

 

- le révélateur photomolybdique : c’est un révélateur universel obtenu en dissolvant 3 g d’acide phosphomolybdique dans 100 ml d’éthanol. A manipuler avec précaution.

 

- le révélateur au p-anisaldéhyde : révélateur universel obtenu en dissolvant 4.5 g de para-anisaldéhyde, 5 ml d’acide acétique à 99 % et 5 ml d’acide sulfurique concentré dans 85.5 ml d’éthanol à 95 %.

 

- le révélateur de Dragendorff : spécifique des amines.

Solution A : solution de nitrate de bismuth (1.7 g), d’acide acétique (20 ml) dans 80 ml d’eau.

Solution B : dissoudre 72 g d’iodure de potassium dans 180 ml d’eau.

On mélange 1.5 ml de A avec 2 ml d’acide acétique, 5 ml d’eau et 1.5 ml de B

 

- l’atomisation : on pulvérise un réactif uniformément sur la plaque.

Le nitrate d’argent pour les halogénoalcanes, la 2.4-DNPH pour les carbonyles et la ninhydrine pour les acides aminés.

 

ATTENTION : lors de la révélation aux UV, le port de lunette de protection adaptée est obligatoire…

  

        4)     Le rapport frontal Rf.

 

Il s’agit ici de réaliser un rapide calcul pour caractériser les composés.

Il s’agit du rapport : distance parcourue par le soluté / distance parcourue par le solvant

 

 

Rf = x/y

Ainsi, un soluté très soluble dans la phase stationnaire aura un RF faible ; alors qu’un composé très soluble dans la phase mobile, verra son Rf proche de 1.

 

Le rapport frontal d’un produit donné dépend de nombreux paramètres : nature du revêtement de la plaque CCM (silice ou alumine), concentration de l’échantillon, nature des solvants d’élution… C’est pourquoi il n’existe malheureusement pas de table de rapports frontaux pour tous les composés organiques.

 

 

IV.   Application de la CCM au suivi d’une réaction

 

L’ensemble des méthodes d’analyses (RMN, IR, LCMS – chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse - …) permettent d’assurer le suivi d’une réaction chimique. C'est-à-dire déterminer :

-         à quel moment les réactifs de départs on été totalement consommés,

-         à partir de quel moment la réaction semble ne plus avancer

-         le nombre de produits formés.

 

La CCM permet également cela, et à bien moindre coût puisse qu’il suffit d’un petit prélèvement du milieu réactionnel, d’un échantillon des réactifs et d’un solvant d’élution.

 

Pour assurer le suivi, on opère généralement comme suit :  

-         un dépôt par réactif de départ

-         un dépôt mélangé (réactifs de départ + milieu réactionnel)

-         un dépôt du milieu réactionnel.

 

Après élution et révélation, on obtient dans le cas où la réaction chimique est terminée le type de plaque suivante :

 

 

On remarque que les deux produits de départs ont totalement réagit pour donner un unique produit.

 

 

V.    Application de la CCM à la purification

 

La CCM va enfin permettre la purification d’un composé. La CCM va alors pouvoir être employée :

-         comme étude préliminaire à une purification par chromatographie liquide flash

-         comme moyen de purification à l’aide de plaque spéciale.

 

Dans le cadre d’une étude préliminaire, la CCM va permettre de sélectionner le solvant ou le mélange de solvant à employer pour permettre une purification efficace d’un produit. En effet, dans le cadre de la chromatographie flash, on essaie de choisir un solvant permettant au composé à purifier d’avoir un rapport frontal inférieur à 0,3.

Les composés avec un rapport supérieur à 0,3 auront tendance à être entraînés par le front de solvant.

En modifiant la polarité du solvant, on se rapprochera de ce rapport fatidique pour le composé à purifier.

 

Enfin, il est possible de purifier les composés directement par CCM. On utilise pour cela des plaques en verre de dimension 20x20 cm avec une importante couche d’absorbant.

Le produit à purifier est dissout dans un solvant et déposé en ligne droite à environ 1.5 cm du bord inférieur de la plaque.

La plaque est ensuite éluée puis séchée. On révèle la plaque sous UV (ce qui permet de repérer où se trouve le produit qui nous intéresse) puis l’on gratte la couche de silice correspondante. Il ne reste plus qu’à extraire le composé de la silice avec un solvant que l’on évaporera pour récupérer notre produit pur.

 

 

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