Etude simultanée de plusieurs paramètres permettant la cristallisation de protéines dans un nouveau type de nanoréacteur

 

S’il n’est pas compliqué d’obtenir de jolis cristaux de chlorure de sodium, la cristallisation de protéine l’est bien plus.

En même temps, vous me demanderez pourquoi chercher à cristalliser des protéines ?

Tout simplement pour ensuite pouvoir les étudier par diffraction de rayons X et ainsi déterminer avec précision leur structure, ce que ne permet pas forcément les autres méthodes mises à la disposition du chercheur (RMN, modélisation moléculaire).

 

La cristallisation de protéine est ainsi délicate puisqu’il faut tester de nombreuses concentrations de cristallisation, divers précipitants. Ces paramètres peuvent assez rapidement être déterminés par des expériences sur de petites quantités de matière par de petites expériences.

 

Récemment, l’équipe de Ruste Ismagilov a imaginé une cellule permettant de réaliser de nombreuses expériences en une fois. Pour cela, ils ont imaginé une nouvelle cellule de cristallisation. Celle-ci se compose de deux plaques coulissantes, chacune gravée d’un circuit permettant la circulation de la protéine ou du précipitant. Cette cellule permet ainsi de tester la cristallisation de la protéine sous l’action de différents précipitants, et pour chaque précipitant à différents ratio protéine/précipitants. Ce sont ainsi 176 expériences qui peuvent être réalisées à la fois par cellule.

 

Fig. 1 : A) Cellule de cristallisation, pas grande cette bête là… B) Représentation schématique de ce cellule de cristallisation. Différents réactifs à différentes concentrations de mélanges sont possibles.

 

Les deux plaques sont superposées et on injecte à l’aide d’une pipette différents précipitants (en jaune) ainsi que la protéine (en vert). Les solutions remplissent des petits réservoirs de différentes tailles en fonctions des ratios de mélange à étudier.

Il suffit ensuite de faire glisser les plaques l’une sur l’autre pour que les réservoirs de précipitants et de protéine se superposent et que les solutions se mélangent.

 

Fig. 2 : Représentation schématique des deux plaques (A et B) puis de leur assemblage (C). La plaque est chargée avec un précipitant (en jaune – D), la protéine (en vert – E) puis les plaques sont glissées et les solutions se mélangent (F).

 

En fonction des ratios et des précipitants, la protéine précipite ou cristallise ou pas…

 

Fig. 3 : Résultats des différents tests de cristallisation. Les résultats sont réarrangés en fonction des concentrations relatives du précipitant et de la protéine.

 

La même équipe est allée encore plus loin en améliorant cette cellule pour qu’elle puisse réaliser des expériences de libre diffusion aux interfaces. Cette technique (FID pour free interface diffusion en anglais) est une méthode intéressante permettant d’envisager le travail sur des quantités nanométriques de matière. Elle est basée sur le fait que lorsque l’on place deux liquides en contact sans les mélanger, ils vont diffuser l’un dans l’autre. Le gradient de concentration de chaque liquide par rapport à l’autre permet de faciliter la cristallisation de protéines par rapport à leur précipitation.

 

Actuellement la FID nécessite généralement l’utilisation de systèmes de valves, pas toujours évidentes à manipuler. L’équipe de Ruste Ismagilov a supposé que la FID pouvait avoir des similitudes avec les techniques de diffusion à contre courant bien documentées dans la littérature et s’adaptant facilement à des systèmes nanométriques.

Son équipe a ainsi réalisé une cellule, basée sur la FID, permettant d’étudier la cristallisation de protéines en fonction de différents paramètres.

 

Comme précédemment, la cellule se compose de deux plaques superposées et l’on injecte à l’aide d’une pipette différents précipitants (en violet, bleu, rouge et rose) ainsi que la protéine (en orange).

Nous sommes alors dans le cas du schéma E (Fig.4) : la protéine en solution s’est placée dans tous les puits oblique en jaune tandis que le précipitant s’est placé dans des réservoirs en bleu. Pour le moment, il n’y a aucun contact entre la protéine et son précipitant.

Lorsque l’on fait glisser les plaques, on met en contact le réservoir de précipitant (en bleu) et le réservoir de protéine (en jaune) par l’intermédiaire d’un conduit plus ou moins large.

Les deux solutions diffusent et la protéine peut cristalliser.

 

Fig. 4 : A) Représentation schématique de la cellule complète : les différents précipitant sont introduits ainsi que la protéine en solution. B, C et D) Représentation schématique des plaques séparées et assemblées. E) Introduction des solutions de protéine (en jaune-orangé) et de précipitant (en bleu). F) Glissage des plaques mettant en contact les solutions qui diffusent à travers les ponts.

 

En fonction de la largeur (58 à 104 µm) et de la longueur (91 à 491 µm) du conduit, la diffusion est plus ou moins rapide, ce qui permet de tester ainsi pour un seul précipitant dix vitesses différentes de diffusion. Il a été noté que pour une diffusion rapide, la protéine avait plutôt tendance à précipiter tandis que pour une diffusion lente, celle-ci cristallise.

 

Fig. 5 : A, B et C) Tests de diffusion entre les deux solutions après glissement des plaques  à T1 = 0 min, T2 = 24 min et T3 = 141 min. On remarque bien que la diffusion est plus rapide pour les conduits courts et larges. F) Microphotographie des réservoirs après diffusion des solutions. Pour les temps de diffusion courts (à gauche) la protéine a tendance à précipiter tandis que plus on augmente le temps de diffusion, plus celle-ci temps à cristalliser (à droite).

 

La cellule permettant de tester plusieurs précipitants à la fois, ce ne sont pas moins de 160 expériences de cristallisation qui peuvent être testées à la fois sur une seule cellule.

 

Cerise sur le gâteau, les chercheurs ont fini par développer une cellule combinant les deux techniques : FID et mélange direct des deux solutions (protéine et précipitant) par lot. Dans ce dernier cas, plusieurs conditions de mélanges peuvent également être testées en variant les rapports de deux solutions (1:2, 1:1 et 2:1).

Cette nouvelle cellule permet ainsi de réaliser un total de 176 expériences à la fois : cinq cristallisation par lot et six par FID pour chacun des 16 précipitants.

 

Fig. 6 : Cellule de seconde génération permettant le mélange direct par lot (microbatch) et la FID.

 

Une fois la protéine cristallisée, il ne reste plus qu’à la soumettre à un flux de rayons X pour prendre un cliché de diffraction révélant son organisation spatiale.

Plusieurs solutions peuvent être envisagées : l’extraction du cristal ou l’irradiation directe à travers la cellule.

Pour l’extraction, il suffirait de séparer les deux plaques de la cellule de test pour ensuite récupérer le cristal.

Pour l’irradiation directe à travers la cellule (présentant l’avantage de faciliter la manipulation sans risque d’abîmer le cristal), il suffirait de placer celle-ci dans un faisceau de rayons X. La cellule devrait cependant être construite à l’aide de matériaux compatibles avec la diffusion des rayons X.

Ces deux techniques restent encore à être testées avec ces cellules de cristallisation.

 

Une autre solution (testée par les chercheurs) consiste à utiliser les meilleures conditions de cristallisation (déterminée par les tests en parallèle) pour réaliser la cristallisation dans des conditions classiques sur une plus grande échelle pour ensuite récupérer les cristaux et les soumettre aux rayons X.

           

Ce nouveau type de cellule de cristallisation devrait largement faciliter la vie des chercheurs en raison de la multitude de conditions pouvant être testées simultanément. De plus, en raison de la grande simplicité de manipulation (dépôt des solutions puis glissage des deux plaques), il devrait être possible d’automatiser cette technique.

 

 

Source : Li, L.; Du, W.; Ismagilov, R. J. Am. Chem. Soc., DOI : 10.1021/ja908555n

   Li, L.; Du, W.; Ismagilov, R.F. J. Am. Chem. Soc., DOI : 10.1021/ja908558m

 

Pour des films expliquant le fonctionnement de ces plaques, n’hésitez pas à aller voir :

-         http://pubs.acs.org/doi/suppl/10.1021/ja908555n

-         http://pubs.acs.org/doi/suppl/10.1021/ja908558m